分子生物学技术from A to Z--IV DNA电泳常见问题与对策

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楼主 2018-12-05 15:17:57
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分子生物学技术from A to Z--IV DNA电泳常见问题与对策

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1. DNA带模糊

1) DNA降解:避免核酸酶污染;

2) 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液;

3) 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力;

4) DNA上样量过多:减少凝胶中DNA上样量;

5) DNA样含盐过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐;

6) 有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白;

7) DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA

2. 不规则DNA带迁移

1) 对于λ/Hind III片段cos位点复性电泳前于65℃加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟;

2) 电泳条件不合适:电泳电压不超过20V/cm;温度<30℃;经常更换电泳缓冲液;

3) DNA变性:20 mM NaCl Buffer稀释DNA,电泳前勿加热。

3. 带弱或无DNA

1) DNA的上样量不够:增加DNA的上样量;聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高,上样量可适当降低;

2) DNA降解:避免DNA的核酸酶污染;

3) DNA走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度;

4) 对于EB染色的DNA,所用光源不合适:应用短波长(254nm)的紫外光源。

4. DNA带缺失

1) DNA带走出凝胶:缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度;

2) 分子大小相近的DNA带不易分辨:增加电泳时间,核准正确的凝胶浓度;

3) DNA 变性:电泳前请勿高温加热DNA链,以20 mMNaCl Buffer稀释DNA

4) DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适:在脉冲凝胶电泳上分析。

5. DNA电泳的Marker怎么是扭曲的?

1配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的。最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面12mm即可。

2电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较整齐了,再调高电压。

3上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

6. PCR电泳后跑电泳,目的基因是490 bp,结果每次切胶回收后再重新电泳条带就变成接近600 bp了?为什么?

有时只靠电泳结果判断是不准确的,同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300 bp,结果就跑到1000 bpMarker下面去了,后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样,是490 bp理论上两个条带一样,可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了,后来又拿去做了下一个测序,才知道根本没有问题。具体问题,具体分析。


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