分析方法验证系列:第九节--生物学检测方法参数验证及案例

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楼主 2020-01-13 13:42:32
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1
专属性

生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密切相关,所以应从测试原理、测试用材料和供试品组成等方面分析方法的专属性。

如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别,应首先对所使用抗体的特异性进行分析;若供试品中还存在其它组分,则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。

如采用细胞测定方法检测生物活性,应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性。为表明细胞测定方法的特异性,可进行相关试验进行验证,如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料,应进行相关验证以排除此种影响。

如采用 ELISA 法检测重组产品的残余宿主蛋白含量,可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体,若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物,则所获得抗体的特异性更好。另外,产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定,应进行相关验证以排除此种影响。

2
准确度

生物制品的生物学活性为相对活性,一般与同时进行测定的标准品/参考品进行比较而得,所以应对单位有一个适当的定义或以适用的标准品/参考品作为对照经计算而得。为得到准确的测定结果,应注意以下几点:

必须同时测定供试品和标准品/参考品的剂量反应曲线,而且两条曲线必须具有平行性。

应尽可能使供试品随机分布及保证测试系统的平衡性。需对引起系统偏差的某些因素进行分析排除,如不同的试验平板、平板的不同位置(如边缘效应)、检测次序、动物实验中的笼子效应等。

以相对效价测定方法为例,准确度验证的范围应包括方法日常使用的范围;可信赖的准确度评估需要测定范围内至少3个效价水平,推荐5个效价水平的评估;最常用的方式是通过稀释标准物质或已知效价的样品获取目标标效,这种类型的方法经常被称为稀释线性试验。

3
精密度

由于各种生物活性测定方法的变异均较大,所以精密度往往不太理想。

重复性的验证,建议在期望的浓度范围内至少选取三个浓度水平,每个浓度至少应测定5次,求得每个浓度水平的精密度。

一个实验室所有常规试验进行时总的变异决定了中间精密度的必要性,建议使用交叉或嵌套的实验结构会揭示程序变异的重要来源,保证长期条件下变异具有代表性。建议在期望的浓度范围内至少选取三个浓度水平,每个浓度至少应测定3次,求得每个浓度水平的精密度。

对于不同测定方法,其精密度可有较大不同,一般情况下,酶法:小于20%;结合试验:小于20%;细胞试验:小于30%;动物试验:小于50%。对于一些尚不成熟的试验方法或某些特殊方法(如噬斑试验),其方法变异可能会更大些。

4
线性

线性关系一般是指检测结果与样品含量的直线相关性,而且一般情况下线性关系是定量测定的基础,所以应尽可能摸索出存在较好线性关系的测定方法并进行线性验证。

线性可以直接对标准品、供试品进行测定。为了建立线性关系,建议至少要用5个浓度点,每一浓度测定3次,每次重复测定3份,用这些结果计算响应值与被分析物的浓度的比例关系,或通过定义明确的数学计算形成比例关系。

某些生物活性测定方法线性范围较小(如细胞测定中呈 S 曲线),采用曲线拟合的方法应更合理。

应提供相关系数、Y 轴上的截距、回归线的斜率等数据,还可以分析实测值与回归线的偏差(离散性),以助于对线性作出评价。

5
范围

具体的范围一般根据检测的目的而设定。验证时所设定的范围应至少包括了产品规范中的范围,如标准中规定成品生物活性应为标示量的80%~120%,则验证的范围可设定为标示量的70~130%。

对于生物制品的生物活性测定而言,精密度、线性和范围是非常重要的验证参数。为减少验证工作的繁杂性,可将范围研究与精密度、线性研究合并进行。

6
耐用性

由于生物学测定结果对分析条件往往比较敏感,所以方法的耐用性验证非常重要,根据具体情况,可针对关键的参数进行耐用性验证。

耐用性是通过有效地改变实验方法的参数,来测定此改变对试验结果的影响,即实验结果不受影响的承受程度。在每种试验条件下,对准确性、精密性、或其他参数进行测定,以确定试验方法的耐受或承受能力。在研制阶段即应进行耐用性的评估,它应能表明在方法的参数有微小改变时该分析方法仍然是可靠的。

7
检测限度和定量限度

对于已建立的杂质检测方法,应进行检测限和定量限验证。检测限和定量限可以通过直观法、信噪比法等测定。

1) 案例分析

以下相对效价测定方法应验证仅供参考。

9-1  相对效价测定方法验证案例

验证项目

验证内容

专属性

基质成分、溶剂单独和混合状态下对效价测定无干扰;

准确度

测试范围内制备5个浓度水平样品,每个浓度重复测定3次;

线性范围

测试范围内配制6-8个浓度样品,每个浓度重复测定3次,每次重复测定3份;

重复性

配制测试范围内高中低3个浓度样品,,每个稀释度测定10次

中间精密度

考察不同测试日期,不同分析者和不同试剂批号间方法精密度,配制测试范围内高中低3个浓度样品,每个浓度测试3次;


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