案例解析:p53调控的lncRNA与SIRT6互作维持干细胞多能性

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楼主 2018-12-05 15:37:08
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1.在人胚胎干细胞(hESC)分化的过程中,寻找P53调控的lncRNA


将这4组细胞样品提取RNA,通过Illumina PE100进行RNA测序,筛选差异表达基因。

差异表达基因可分为4类:a.RA诱导分化过程中被激活的基因,b.RA诱导分化过程中被抑制的基因,c.p53抑制基因,d.p53激活的基因。通过p < 0.005,FDR < 0.001进一步筛选,找到在分化过程中受TP53调控的lncRNA有102个。

为了寻找P53直接调控的lncRNA,作者将RA处理的hESC细胞使用P53抗体进行ChIP-seq,从中找到40个受P53直接调控的lncRNA,其中18个被P53激活,22个被抑制。

由于在RA诱导的hESC分化过程中,P53是被激活的,所以在分化过程中受P53抑制的转录本可能具有维持多能性的功能,作者将这些受P53直接抑制调控的lncRNA命名为lncPRESS。

由于在分化过程中,相关转录本的差异表达是受表观调节的,所以作者对基因甲基化模式的变化进行分析。将RA处理2天和无RA处理的hESC进行H3K4me3和H3K27me3的ChIP-seq,分析甲基化修饰模式的变化。结果如下:

在分化过程中,P53激活的lncRNA基因上H3K27me3修饰程度大幅下降,且H3K4me3修饰程度轻微上升。在受P53抑制调控的lncRNA基因上H3K27me3在转录起始位点上下游分布均为低水平,且不受RA诱导分化影响,H3K4me3修饰程度经诱导有小幅下降。

在hESC分化过程中,40个lncRNA受到P53直接调控,且这40个lncRNA的差异表达是受组蛋白修饰控制的。


 2.在胚胎分化过程中lncRNA受p53调控

在不同的分化方向上检测P53对lncRNA的调控作用,RA主要诱导神经外胚层分化,BMP(bone morphogenicprotein,成骨蛋白)主要诱导中胚层分化。分别用RA和BMP处理hESC5天,检测受P53直接调控的lncRNA的表达。作者从之前筛选的40条p53调控的lncRNA中选择了3条最具代表性的lncRNA进行研究。

1)lncPRESS1,756nt长链多外显子基因间lncRNA,EnsemblNo:ENSG00000232301;

2)lncPRESS2,1238nt长链多外显子基因间lncRNA,EnsemblNo:ENSG00000249152;

3)HOTAIRM1,1052nt长链多外显子反义转录本lncRNA,EnsemblNo:ENSG00000233429;HOTAIRM1是已经报道的HOXA反义转录本,在NB4早幼粒细胞白血病和正常造血细胞的粒细胞分化中上调。HOTAIRM1干扰后功能表明在白血病中HOTAIRM1在HOXA基因簇调控基因表达。

从结果可以看出,在hESC分化过程中lncPRESS1,lncPRESS2的表达逐渐下降,HOTAIRM1的表达逐渐上升,说明lncPRESS1,lncPRESS2是细胞多能性相关的特异转录本,HOTAIRM1是细胞分化相关的特异转录本。

同时作者也验证了TP53敲除对这三种lncRNA的表达的影响,结果证明分化过程中这三种lncRNA的表达都是受TP53调控的。


为了确定P53如何调控这些lncRNA的表达,作者对RA诱导的hESC进行P53,H3K4me3和H3K27me3的ChIP-seq实验,结果如下:

在P53调控的lncRNA的基因上游都有P53的结合峰,RA处理后,lncPRESS1的基因序列上H3K4me3修饰程度下降且H3K27me3修饰程度上升,而在HOTAIRM1的基因序列上H3K4me3修饰程度显著上升且H3K27me3修饰程度下降。此外通过ChIP-PCR的结果也证实了这些组蛋白修饰上的变化也是受P53调控的。

p53结合位点如下图所示:

 

3.基于P53调控lncRNA簇的单细胞转录组分析

由于在分化过程中,细胞的异质性可能会影响基因表达的时空特异性。作者用微流体芯片来分析基因在分化过程中的瞬时表达。在超过300个单细胞中,分析了多能性或者分化特异性相关的基因和P53调控的非编码RNA总共28个转录本的表达。收集向外胚层(dEC),中胚层(dME),内胚层(dEN)3个方向分化的的hESC。通过qRT-PCR检测这28个转录本的表达,其表达量和PCA主成分分析如下:

作者研究TP53对hESC分化为外胚层(dEC),中胚层(dME),内胚层(dEN)的影响,使用RT-PCR检测相关基因的表达,结果显示,在分化2天后,基因FOXA2(内胚层标志基因),HIND1(内胚层和中胚层标志基因),GATA2(中胚层标志基因)的上调因TP53的敲除而放缓。说明P53缺失延缓了RA介导的人胚胎干细胞的分化。

随后作者通过RNA-seq和组蛋白ChIP-seq分析了hESC分化为中胚层细胞(HUVEC),外胚层细胞(NHEK)和内胚层细胞(NHLF)过程中的变化。结果如下:

结果显示在hESC中,lncPRESS1和lncPRESS2是高度激活的,且其所在基因上的H3K4me3和H3K79me2修饰程度高度富集,而H3K27me3修饰几乎没有。这表明lncPRESS1和lncPRESS2是多能性相关的转录本,而HOTAIRM1是分化特异性的转录本。并且在分化过程中他们的差异表达是受到组蛋白修饰调控的。

 

4. lncPRESS1对hESC多能性的影响

作者使用两种lncPRESS1靶向的shRNA序列来构建带有不同敲除效率(shRNAa有35%的敲除效率,shRNAb有70%的敲除效率)的稳定的hESC细胞系。lncPRESS1的表达下降导致了多能性标志基因OCT4和NANOG的表达显著下降,并诱导了分化特异性的基因PAX6,HOXA1,HOTAIRM1和FOXA2的表达。

由于shRNAb有更好的敲低效率,所以选择shRNAb进行分析。对使用shlncPRESS1b和shcontrol进行敲除的hESC进行RNA-seq,找到1638个差异表达基因,经功能分析发现lncPRESS1激活的基因有干细胞相关功能。这个结果表明lncPRESS1具有维持hESC多能性的特点,而lncPRESS1的缺失可促进细胞分化。

 

5.lncPRESS1与SIRT6互作调节H3K56/K9ac水平

LncRNA一般是通过与蛋白质相互作用来对转录或者转录后进行调控,(这也是lncRNA研究的套路)。作者使用生物素化的lncPRESS1进行RNApull-down实验,用质谱分析与lncPRESS1结合的蛋白。结果显示与lncPRESS1互作的蛋白有SIRT6、HIF-1a、TRIM28、CNOT4。在2个重复实验中,SIRT6与lncPRESS1的互作都表现出较高可信度。

已有研究表明SIRT6通过调节H3K56ac的水平来决定胚胎干细胞的命运。所以作者优先解析lncPRESS1与SIRT6复合体的功能。作者用SIRT6的抗体进行RIP实验验证,对免疫沉淀下来的复合体进行qRT-PCR实验,结果证实lncPRESS1在复合体中高度富集。

作者推测hESC中多能性特异性的lncPRESS1可能作为lncRNA诱饵招募SIRT6,从而阻止SIRT6与染色体结合。同时SIRT6的亚细胞定位显示lncPRESS1缺失导致SIRT6更多的富集到染色体片段上,且RA处理降低了lncPRESS1表达、并促使SIRT6向染色体片段上富集,不论是lncPRESS1缺失还是RA处理引起的分化都会导致H3K56ac的水平以剂量依赖性的下降。lncPRESS1缺失使染色体相关的H3K56ac水平降低了45%、H3K9ac水平下降了30%。这些结果表明lncPRESS1缺失引起lncPRESS1-SIRT6复合体减少导致SIRT6更多的与染色体结合使H3K56/K9ac水平降低,多能性相关基因的表达受到抑制。

 

6.lncPRESS1参与调控SIRT6介导的H3K56/K9ac去乙酰化和多能性相关基因表达

 

ChIP-PCR的结果发现RA诱导分化的时候,在hESC多能性相关的基因的启动子上,SIRT6表现出显著性的富集且H3K56/K9ac的程度下降。敲低lncPRESS1,同样引起SIRT6与多能性相关基因结合,以及H3K56/K9ac的程度下降。综上,SIRT6通过与多能性基因相结合引起H3K56/K9ac的去乙酰化来影响胚胎干细胞的分化。


至此,p53-lncRNA-SIRT6-组蛋白乙酰化修饰这个调节干细胞多能性的调控途径已经阐述清楚。

 

7. 研究思路梳理


参考文献:Jain A K, Xi Y, Mccarthy R, et al. LncPRESS1 Is ap53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-MediatedDe-acetylation of Histone H3K56.[J]. Molecular Cell, 2016, 64(5):967.

 

文章中使用的ChIP-seq、RNA-seq技术都是康测科技擅长的。

 

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