Ä爱纯派 包涵体纯化攻略

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楼主 2019-11-05 16:33:58
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是最长情的告白

陪伴

Ä
爱纯

客户
小丸子
紫薇格格和霍阿哥在一起了,累觉不爱,我要滚回去做试验了
唉,我的蛋白又形成包涵体了,包涵体如何纯化呢?
客户
小玉
实验室
花轮
蛋白在复性过程中形成沉淀了,怎么办?
包涵体纯化后收率很低,如何优化呢?
实验室
杏子


随着基因重组技术的发展,越来越多的蛋白可以在外源宿主细胞中进行表达。其中最常使用的表达宿主就是大肠杆菌。大肠杆菌具有快速、高效、成本低等多种优势。但是另一方面大肠杆菌为原核细胞,由于蛋白表达后修饰的系统不完善及表达快速,外源蛋白尤其是真核细胞蛋白,在大肠杆菌中进行表达过程中,错误的折叠会导致蛋白质发生聚集而形成包涵体。这仍然是蛋白质科学中的一个瓶颈问题。

一般而言,我们可以通过改变上游细胞的培养条件,如降低表达温度、减少培养时间、降低诱导剂IPTG的浓度等方法避免包涵体的形成,使得我们的目标蛋白以天然状态的可溶性蛋白形式进行表达。如果无法改变情况,我们也可以对包涵体进行纯化。虽然包涵体会为活性蛋白的纯化带来困难,但是包涵体一般具有高表达水平、高纯度、对蛋白酶的抵抗性比较高、不易被降解、样品制备比较简单的优势。

包涵体复性过程模式图


当蛋白质被表达为不可溶的包涵体时,要得到具有功能的天然态蛋白,首先必须在变性剂中分散包涵体,这样可以得到一种溶液,这种溶液中的蛋白是去折叠的多肽链。该步骤叫做溶解。下一个步骤就是通过去除变性剂,得到具有独特构象、功能构象和三维构象的蛋白质。该步骤称为重折叠或复性(见上图)。通过复性操作方式的不同,主要分为稀释、透析和柱上复性(见下表)。其中稀释和透析是将包涵体复性和蛋白纯化分步进行的方法,可以先纯化再复性,也可以先复性再纯化;而柱上复性是在蛋白复性的过程中即对蛋白进行纯化。

不同包涵体复性技术比较

蛋白质折叠是热力学驱动的结果。热力学驱动导致特定非共价相互作用和二硫键的形成,这是具有功能状态的特征。换言之,蛋白质的天然状态要比其去折叠状态稳定。决定着两种状态相对稳定性的信息只存在于蛋白质的一级序列信息中。因此,我们在进行蛋白复性前,需要了解蛋白的一级序列:第一,蛋白中半胱氨酸的数目。如果含有二硫键的话,在复性的过程就需要筛选合适的还原剂及浓度充分溶解包涵体。第二,蛋白质的一级序列中是否含有脯氨酸,如果含有脯氨酸,我们可能需要异构酶来辅助折叠。

影响蛋白质折叠的速率和收率的因素
温度
低温操作,可以降低蛋白复性速度,防止由于过快而导致错配,支持生产级别的复性操作,但是过程比较慢。高温时复性的速率比较高,但是易于发生聚集。一般建议复性的起始温度可以尝试15℃
添加剂
添加剂一方面可以促进结构形成,增强蛋白-蛋白之间的相互作用。如pH,缓冲物质,盐,甘油等。另一方面可以提高溶解性,抑制聚集体的形成,降低侧链的相互作用,如:去垢剂,精氨酸,低浓度的尿素和盐酸胍,PEG等。在进行包涵体纯化的相关缓冲液中会含有以上一种或多种添加剂的成分,并且添加剂的类型和浓度都是要根据不同的蛋白进行筛选的
氧化还原剂
除了温度和添加剂外,对于含有半胱氨酸,需要形成二硫键的蛋白来说,还需要使用一些氧化还原剂等。常用的还原剂如DTT,β-ME等一方面可以在溶解阶段彻底还原二硫键,另一方面可以保护游离的二硫键不被氧化。而氧化剂可以帮助复性,形成正确的二硫键。复性缓冲液中常常需要添加一定比值的GSH/GSSG,为蛋白复性提供一个氧化还原的环境


包涵体纯化一般包括哪些步骤呢?
包涵体复性操作流程


首先蛋白质表达,然后收集细菌进行裂解离心,得到粗制包涵体
 
使用含有低浓度变性剂(如2M尿素)或不含变性剂的缓冲液清洗包涵体,去除一部分杂蛋白,通过离心得到精制包涵体
 
使用高浓度变性剂(如8M尿素或6M盐酸胍)的缓冲液对精制包涵体进行溶解
 
溶解的包涵体可以通过稀释或透析的方法先进行复性,然后再进行纯化;或者先纯化然后再进行复性。或者将溶解后的包涵体蛋白进行柱上复性,实现复性和纯化同步进行。一般来讲分子筛(SEC)、金属离子螯合层析(Ni2+)、离子交换(IEX)及疏水(HIC)可以耐受高浓度的变性剂,因此可以使用不同的层析技术进行柱上复性,但是需要注意高浓度变性剂或缓冲液中的其他成分是否会影响蛋白与填料之间的相互作用等。
 
最后,我们还需要对得到的样品进行检测分析,是否得到天然态的蛋白。一般检测方法包括生物活性检测,圆二色谱法,动态光散射或凝胶过滤,反相层析等

柱上复性应用举例
1
凝胶过滤复性技术

凝胶过滤法复性技术根据其平衡阶段的策略不同主要有两种方法:方法一是用复性缓冲液平衡层析柱,然后将变性的样品直接上柱复性。方法二是在上样前,通过变性缓冲液与复性缓冲液在柱上设置一个降低的变性剂梯度,然后再上样(见下图)。方法一的缺点在于变性蛋白在快速去除变性剂的条件下易发生聚集。实验表明,方法二的成功率要高于方法一

溶菌酶用凝胶过滤法进行尿素梯度复性。“*”:溶菌酶复性蛋白。蓝色曲线:UV280nm;棕色曲线:电导;红色曲线是尿素的理论值

2
亲和层析复性技术

凝胶过滤法复性技术根据其平衡常用的亲和层析技术主要应用在携带组氨酸标签的包涵体蛋白复性。一般步骤为:平衡(含有变性剂的平衡缓冲液)-上样-复性(尿素梯度)-洗脱(咪唑梯度),见下图

His·tag包涵体蛋白复性

除凝胶过滤和亲和层析可以进行柱上复性外,还可以进行离子交换层析和疏水层析进行柱上复性。
进行离子交换层析复性时,溶解的包涵体蛋白在变性的条件下结合在柱子上,然后通过设置降低的尿素梯度进行复性,最后通过高盐或pH改变进行洗脱,这是经典的“三步法”。三步法有时会由于变性聚集的蛋白牢固结合在柱子上,从而降低复性产率,此时,可采用“两步法”和/或“尿素+pH双梯度法”进行改进。
进行疏水层析复性时,蛋白的亲水端面向流动相,不会形成聚集体。在热力学驱动下,复性的蛋白会快速的与它的中间态和去折叠的蛋白发生分离。同离子交换层析复性,蛋白与填料之间多点结合,降低变性蛋白的自由度,传统方法的收率比较低,可以使用脉冲洗脱法(pulse elution)促进蛋白释放,可以显著提高收率。脉冲洗脱法即:在复性缓冲液进行洗脱前,先向柱子上添加小体积的含有高浓度变性剂的溶液,促进蛋白释放,然后再进行复性洗脱。另外还可以向洗脱液中添加甘油,PEG等成分,帮助蛋白分子正确折叠。

包涵体复性Tips
包涵体清洗
需要筛选合适的尿素浓度(2~4M),使目的蛋白维持包涵体形式
溶解
筛选合适的变性剂浓度(如:8M尿素、6M盐酸胍),有时需要添加还原剂(DTT/β-ME等)还原二硫键
复性
需要筛选合适的缓冲液成分,甘油或者低浓度的尿素等添加剂可以有效抑制蛋白质的沉淀。对于稀释和透析,适当延长复性时间或者减缓变性剂的去除速度,可以提高蛋白质复性的正确率
总蛋白浓度
筛选合适的蛋白浓度,一般0.1~0.5mg/ml

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