细菌中蛋白质的提取与纯化技术

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楼主 2019-02-11 10:14:04
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实验试剂


采用T7• Tag Affinity Purification Kit

T7•Tag抗体琼脂。B/W缓冲液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 0.137mM NaCl,1%吐温-20,pH7.3 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸,pH2.2. 中和缓冲液:2M Tris,pH10.4。 PEG 20000。


实验步骤


1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5000g×5min,弃上清,收获菌体,用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。

2. 重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4℃离心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽滤后作为样品液。

3. 将结合T7•Tag抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。

4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。

5. 10ml B/W缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。

6. 用5ml洗脱缓冲液过柱,每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。

7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24hr,中间换液数次。

8. 用PEG 20000浓缩蛋白。


注意事项


蛋白在过层析柱前,要0.45μm膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。


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